Interaktionen zwischen Mastzellen und submukösen Neuronen unter Entzündungsbedingungen ex vivo und in vitro
von Jasmin BalloutDie Rolle von Mastzellen bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD) wird kontrovers diskutiert. Einige Studien berichten über eine erhöhte Mastzelldichte bei IBD, wohingegen andere Studien eine Abnahme registrierten. Da Mastzellmediatoren dafür bekannt sind die intestinale Sekretion und Permeabilität zu erhöhen, stellte ich die Hypothese auf, dass eine Antigenantwort in sensibilisierten Tieren unter Entzündungsbedingungen ex vivo erhöht sein könnte, was zu der inadäquaten Immunantwort bei IBD beitragen würde.
Daher wurde eine Gruppe von Ratten gegen Ovalbumin sensibilisiert und in einer zweiten Gruppe eine zusätzliche Kolitis mittels TNBS (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure) induziert. In Ussing-Kammer-Experimenten wurden der Kurzschlussstrom (Isc), die Gewebeleitfähigkeit (Gt) sowie die parazelluläre Permeabilität von Segmenten des distalen Kolons (lokal entzündet) und Jejunums (nicht entzündet) gemessen. Parallel dazu wurden Mastzellmarker und Tight Junction Proteine mittels Immunfluoreszenz und qPCR bestimmt. Im Gegensatz zu der initialen Hypothese war der Antigen-induzierte Isc in Ussing-Kammer-Experimenten nicht erhöht, sondern zeigte eine tendenziell erniedrigte Anionensekretion im distalen Kolon und (wenn auch in geringerem Ausmaß) im Jejunum nach Kolitis-Induktion. Die Mastzelldichte war annähernd unverändert im distalen Kolon, wohingegen diese im Jejunum im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen um ca. 230 % nach Sensibilisierung anstieg. Nur im Jejunum führte der Antigenkontakt in der Ussing-Kammer zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität im Gewebe sensibilisierter Tiere. Dieser Effekt blieb unbeeinflusst durch die zusätzliche Kolitis-Induktion. Die Expression der abdichtenden Tight Junction Proteine Claudin-3 und Claudin-4 auf Proteinebene war nach vorheriger Sensibilisierung in beiden Darmsegmenten signifikant erhöht; die zusätzliche Kolitis-Induktion führte zu einer Downregulation von Claudin-3.
Aufgrund der erniedrigten Mastzell-vermittelten Isc-Antwort unter Entzündungsbedingungen untersuchte ich weiterhin, ob proinflammatorische Zytokine in vitro die Antwort des Darmepithels und der submukösen Neurone auf eine Mastzelldegranulation modulieren. TNFα sowie ein Zytokinmix (TNFα + IL-1β + IFN-γ) bewirkten einen Anstieg des Isc und der Gt im distalen Kolon der Ratte. Die Mastzellaktivierung mittels Compound 48/80 blieb davon unberührt. Dahingegen war eine Stimulation der Ca2+-abhängigen Anionensekretion (durch Histamin oder Carbachol) signifikant erniedrigt, nachdem das Gewebe mit IL-1β oder dem Zytokinmix vorbehandelt wurde. Ca2+-Imaging-Experimente zeigten eine erhöhte neuronale Aktivität nach 1-tägiger Inkubation einer Cokultur, bestehend aus submukösen Neuronen und einer Ratten-spezifischen Mastzelllinie (RBL-2H3), mit TNFα. Eine 3-tägige Inkubation der Cokultur mit dem Zytokinmix induzierte eine Apoptose in den RBL-2H3, wohingegen sich die Anzahl der Neurone, welche auf eine Mastzelldegranulation hin stimuliert wurden, signifikant erhöhte. Demzufolge könnte die Downregulation der epithelialen Sekretion durch eine erhöhte Sensitivität sekretomotorischer Neurone kompensiert werden, was zu einer konstanten epithelialen Sekretion nach Mastzellaktivierung führt. Zudem kann die Mastzellfunktion durch enterische Neurone moduliert werden, da die Stimulation nikotinerger Rezeptoren sowohl den Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration als auch den Isc-Anstieg nach Mastzellaktivierung durch Compound 48/80 hemmt.
Diese Studie ist ein weiterer Beweis für die Anpassungsfähigkeit von Mastzellen und für die segmentabhängigen Unterschiede in den Mastzell-Epithel-Interaktionen unter Entzündungsbedingungen sowie für den starken Einfluss der enterischen Neurone, welche Immun- und Epithelfunktionen koordinieren.
Daher wurde eine Gruppe von Ratten gegen Ovalbumin sensibilisiert und in einer zweiten Gruppe eine zusätzliche Kolitis mittels TNBS (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure) induziert. In Ussing-Kammer-Experimenten wurden der Kurzschlussstrom (Isc), die Gewebeleitfähigkeit (Gt) sowie die parazelluläre Permeabilität von Segmenten des distalen Kolons (lokal entzündet) und Jejunums (nicht entzündet) gemessen. Parallel dazu wurden Mastzellmarker und Tight Junction Proteine mittels Immunfluoreszenz und qPCR bestimmt. Im Gegensatz zu der initialen Hypothese war der Antigen-induzierte Isc in Ussing-Kammer-Experimenten nicht erhöht, sondern zeigte eine tendenziell erniedrigte Anionensekretion im distalen Kolon und (wenn auch in geringerem Ausmaß) im Jejunum nach Kolitis-Induktion. Die Mastzelldichte war annähernd unverändert im distalen Kolon, wohingegen diese im Jejunum im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen um ca. 230 % nach Sensibilisierung anstieg. Nur im Jejunum führte der Antigenkontakt in der Ussing-Kammer zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität im Gewebe sensibilisierter Tiere. Dieser Effekt blieb unbeeinflusst durch die zusätzliche Kolitis-Induktion. Die Expression der abdichtenden Tight Junction Proteine Claudin-3 und Claudin-4 auf Proteinebene war nach vorheriger Sensibilisierung in beiden Darmsegmenten signifikant erhöht; die zusätzliche Kolitis-Induktion führte zu einer Downregulation von Claudin-3.
Aufgrund der erniedrigten Mastzell-vermittelten Isc-Antwort unter Entzündungsbedingungen untersuchte ich weiterhin, ob proinflammatorische Zytokine in vitro die Antwort des Darmepithels und der submukösen Neurone auf eine Mastzelldegranulation modulieren. TNFα sowie ein Zytokinmix (TNFα + IL-1β + IFN-γ) bewirkten einen Anstieg des Isc und der Gt im distalen Kolon der Ratte. Die Mastzellaktivierung mittels Compound 48/80 blieb davon unberührt. Dahingegen war eine Stimulation der Ca2+-abhängigen Anionensekretion (durch Histamin oder Carbachol) signifikant erniedrigt, nachdem das Gewebe mit IL-1β oder dem Zytokinmix vorbehandelt wurde. Ca2+-Imaging-Experimente zeigten eine erhöhte neuronale Aktivität nach 1-tägiger Inkubation einer Cokultur, bestehend aus submukösen Neuronen und einer Ratten-spezifischen Mastzelllinie (RBL-2H3), mit TNFα. Eine 3-tägige Inkubation der Cokultur mit dem Zytokinmix induzierte eine Apoptose in den RBL-2H3, wohingegen sich die Anzahl der Neurone, welche auf eine Mastzelldegranulation hin stimuliert wurden, signifikant erhöhte. Demzufolge könnte die Downregulation der epithelialen Sekretion durch eine erhöhte Sensitivität sekretomotorischer Neurone kompensiert werden, was zu einer konstanten epithelialen Sekretion nach Mastzellaktivierung führt. Zudem kann die Mastzellfunktion durch enterische Neurone moduliert werden, da die Stimulation nikotinerger Rezeptoren sowohl den Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration als auch den Isc-Anstieg nach Mastzellaktivierung durch Compound 48/80 hemmt.
Diese Studie ist ein weiterer Beweis für die Anpassungsfähigkeit von Mastzellen und für die segmentabhängigen Unterschiede in den Mastzell-Epithel-Interaktionen unter Entzündungsbedingungen sowie für den starken Einfluss der enterischen Neurone, welche Immun- und Epithelfunktionen koordinieren.