Neuronale Differenzierung caniner mesenchymaler Stammzellen aus dem Fettgewebe über den Zwischenschritt der Bildung dreidimensionaler Sphären
von Laura Beate HeilenDer Einsatz regenerativer Therapien und insbesondere eine Nutzung von cMSCs zur Behandlung neurologischer Erkrankungen des Hundes ist sehr vielversprechend. Dennoch ist die genaue Rolle, welche cMSCs während des Heilungsprozesses innehaben könnten, bisher weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern cMSCs nach einer erfolgten neuronalen Differenzierung neuronale Eigenschaften aufweisen. Dazu wurde in einem Zwischenschritt die Bildung dreidimensionaler Sphären, welche Neurosphären imitieren sollten, angeregt. Bei den verwendeten Diffe-renzierungsmedien erfolgte eine starke Orientierung an denen, welche zur Kultivierung caniner neuronaler Zellen verwendet werden. Dies und der Zwischenschritt einer Sphärenbildung sollten ein möglichst physiologisches Milieu zur Differenzierung der Zellen schaffen.
Dazu wurden cMSCs aus dem Fettgewebe gewonnen und nach ihrer erfolgreichen Charakterisierung in einem neuronalen Prädifferenzierungsmedium, bestehend aus Basismedium, Supplementen und Wachstumsfaktoren, für 3 Tage zur Sphärenbildung angeregt. Als Basismedium wurde DMEM/F-12 verwendet, bei den genutzten Supplementen handelte es sich um N2 und B-27 und als Wachstumsfaktoren wurden EGF und bFGF hinzugegeben. Versuchsweise erfolgte ein Zusatz von Natrium-Heparin. Der fehlende Zusatz von Serum und eine antiadhäsive Oberflächenbeschichtung waren entscheidend für die Sphäreninduktion. Es erfolgte eine Untersuchung der Sphären hingehend ihrer Morphologie und Vitalität. Hierdurch sollte ein Vergleich mit Neurosphären ermöglicht werden. Durch die Analyse metrischer Aspekte wurde der Einfluss verschiedener Medienkomponenten auf die Sphärenbildung beurteilt.
Anschließend erfolgte die siebentägige neuronale Weiterdifferenzierung der Sphären. Dazu wurden diese in Weiterdifferenzierungsmedium auf einer adhäsiven Oberfläche kultiviert. Das Medium setzte sich aus dem gleichen Basismedium und Supplementen zusammen. Außerdem erfolgte eine Zugabe von 2,5 % FKS und die Wachstumsfaktoren wurden durch die Neurotrophine NGF und BDNF ersetzt. Der FKS-Zusatz und die Kultivierung der Sphären auf einer adhäsiven Oberfläche waren entscheiden für das Anwachsen und Auswandern der Zellen. Im Anschluss erfolgte eine morphologische Beurteilung der Zellen.
Undifferenzierte cMSCs, Sphären und cMSCs nach viertägiger und siebentägiger Weiter-differenzierung wurden mittels RT-qPCR, Immunfluoreszenz und Western Blot hingehend ihrer Expression neuronaler Marker untersucht.
Im Folgenden sind die relevanten Ergebnisse aufgeführt:
Im Folgenden sind die relevanten Ergebnisse aufgeführt: