New insights into the role of cholesterol-related pathways in apicomplexan parasite infections
von Camilo Sebastián Larrazabal ReyesKokzidien sind Krankheitserreger von Mensch und Tier und gehören zu obligat intrazellulären Parasiten, die im Stamm der Apikomplexa eingeordnet werden. Veterinärmedizinisch relevante Kokzidien befinden sich in verschiedene Familien, wie den Sarcocystidae (z. B. Toxoplasma gondii, Neospora caninum und Besnoitita besnoiti) und Eimeriidae (z. B. Eimeria bovis und Eimeria arloingi), die sich hinsichtlich Lebenszyklus und Wirtsspezifität unterscheiden. Diese intrazellulär lebenden Parasiten sind für ihre Entwicklung vom Metabolismus ihrer Wirtszelle abhängig. So werden komplexe Moleküle - wie etwa Cholesterol - aus den Wirtszellen entnommen, um die proliferativen Anforderungen des Parasiten zu erfüllen. Grundsätzlich können Zellen Cholesterol durch de-novo-Biosynthese oder extrazelluläre Aufnahme bereitstellen. Letztere wird vornehmlich über die Aufnahme von LDL vermittelt. Vor allem diesen Weg scheinen Kokzidien für sich zu nutzen. Insgesamt sind jedoch sind die Kenntnisse zur Cholesterolaufnahme durch Kokzidien noch lückenhaft und nicht für alle Arten repräsentativ. So wurden alternative Aufnahmewege zum Cholesterol, die von bestimmten Rezeptoren und Transportern wie NPC1L1, P-pg oder SR-BI abhängig sind, bisher kaum in Betracht gezogen. Die vorliegende Arbeit befasst sich deshalb mit dieser Thematik und führte zu folgenden Ergebnissen:
Eine GC-MS-basierte Analyse von Cholesterol-assoziierten Sterolen in B. besnoiti-infizierten primären Endothelzellen zeigte eine Zunahme von Cholesterol-Vorstufen. Zusammen mit einer Statin-vermittelten Hemmung der B. besnoiti-Replikation deuten diese Daten auf eine wichtige Rolle der de-novo Biosynthese in infizierten Wirtszellen hin. Dass die acLDL-Supplementierung die B. besnoiti-Vermehrung verstärkte, weist zudem auf acLDL als zusätzliche, extrazelluläre Cholesterolquelle hin und zeigte auf, dass dieser Parasit alternative Wege zur Deckung des Cholesterolbedarfs nutzt. Im Falle von E. bovis-Infektionen belegten Sterolanalysen eine signifikante Zunahme von Phytosterolen während der ersten Merogonie, was auf eine Abhängigkeit der intrazellulären Parasitenentwicklung von extrazellulären Cholesterolquellen hinweist. Zudem ergab die Analyse von Cholesterinmetaboliten eine gesteigerte Bildung von Cholesterylestern und Oxysterolen (insbesondere 25-Hydroxycholesterin). Da der exogene Zusatz von Oxysterolen die Entwicklung von E. bovis Makromeronten behinderte, könnte die gesteigerte Synthese dieser Moleküle auch Ausdruck einer Abwehrreaktionen infizierter Wirtszellen sein.
Eine Beteiligung weiterer cholesterolassoziierter Wege zeigte die Anwendung von Ezetimib als NPC1L1-Blocker, die signifikante parasitostatische Effekte auf die Proliferation von T. gondii-, N. caninum- und B. besnoiti-Tachyzoiten ergab. Behandlungen mit dem in vivo aktiven Metaboliten (glucuroniertes Ezetimib) bewirkten jedoch keine parasitostatische Wirkungen. Zusammen mit der inkonsistente Genexpression von NPC1L1 in infizierten Zellen legte dies nahe, dass Ezetimib die Parasitenreplikation durch einen NPC1L1-unabhängigen Mechanismus beeinflusst. Außerdem zeigte die chemische Blockade des im Cholesterolstoffwechsel eingebundenen ABC-Transporters P-gp durch verschiedene Inhibitorgenerationen (Verapamil, Valspodar, Tariquidar) deutliche Unterschiede in ihrer antiparasitären Wirksamkeit. Während Behandlungen mit Verapamil signifikant die Replikation von T. gondii, N. caninum und B. besnoiti hemmten und eine Anreicherung neutraler Lipide in Wirtszellen erzeugten, zeigten Valspodar-Behandlungen zwar ebenfalls anti-invasive und anti-proliferative Wirkungen, ohne jedoch die Abundanz neutraler Lipide zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu verringerte der spezifischste P-gp-Inhibitor Tariquidar ausschließlich die Invasion und Replikation von B. besnoiti, wirkte sich jedoch nicht auf T. gondii oder N. caninum aus, was parasitenspezifische Reaktionen nahelegt. Interessanterweise induzierte die Blockade des Scavenger-Rezeptors SR-BI durch BLT-1-Behandlungen signifikante hemmende Effekte sowohl auf die schnell replizierenden Kokzidien T. gondii, N. caninum und B. besnoiti als auch auf die pathogenen Eimeria-Spezies E. bovis und E. arloingi, was konservierte, SR-BI-assoziierte Mechanismen bei der intrazellulären Kokzidien-Replikation nahelegt. BLT-1-Behandlungen freier Sporozoiten und Tachyzoiten beinflussten jedoch ausschließlich die invasive Kapazität der letzteren Gruppe, begleitet von einem anhaltenden Ca++-Flux in diesen Parasitenstadien.
Schließlich belegten Studien zum Zellaustritt von N. caninum über Live-Cell-Imaging, dass dieser mit einer infektionsbedingten Ca++-Umverteilung mit erhöhten Ca++-Signalen innerhalb der Meronten verbunden war. Analysen zum ionophorinduzierten Austritt von N. caninum zeigten zudem, dass die Austrittsleistung des Parasiten hauptsächlich von der Merontenreife beeinflusst wurde und dass Ionophorbehandlungen keine Ca++-Umverteilung zwischen unterschiedlichen Infektionszeitpunkten (24 oder 42 h p. i.) verursachte.
Eine GC-MS-basierte Analyse von Cholesterol-assoziierten Sterolen in B. besnoiti-infizierten primären Endothelzellen zeigte eine Zunahme von Cholesterol-Vorstufen. Zusammen mit einer Statin-vermittelten Hemmung der B. besnoiti-Replikation deuten diese Daten auf eine wichtige Rolle der de-novo Biosynthese in infizierten Wirtszellen hin. Dass die acLDL-Supplementierung die B. besnoiti-Vermehrung verstärkte, weist zudem auf acLDL als zusätzliche, extrazelluläre Cholesterolquelle hin und zeigte auf, dass dieser Parasit alternative Wege zur Deckung des Cholesterolbedarfs nutzt. Im Falle von E. bovis-Infektionen belegten Sterolanalysen eine signifikante Zunahme von Phytosterolen während der ersten Merogonie, was auf eine Abhängigkeit der intrazellulären Parasitenentwicklung von extrazellulären Cholesterolquellen hinweist. Zudem ergab die Analyse von Cholesterinmetaboliten eine gesteigerte Bildung von Cholesterylestern und Oxysterolen (insbesondere 25-Hydroxycholesterin). Da der exogene Zusatz von Oxysterolen die Entwicklung von E. bovis Makromeronten behinderte, könnte die gesteigerte Synthese dieser Moleküle auch Ausdruck einer Abwehrreaktionen infizierter Wirtszellen sein.
Eine Beteiligung weiterer cholesterolassoziierter Wege zeigte die Anwendung von Ezetimib als NPC1L1-Blocker, die signifikante parasitostatische Effekte auf die Proliferation von T. gondii-, N. caninum- und B. besnoiti-Tachyzoiten ergab. Behandlungen mit dem in vivo aktiven Metaboliten (glucuroniertes Ezetimib) bewirkten jedoch keine parasitostatische Wirkungen. Zusammen mit der inkonsistente Genexpression von NPC1L1 in infizierten Zellen legte dies nahe, dass Ezetimib die Parasitenreplikation durch einen NPC1L1-unabhängigen Mechanismus beeinflusst. Außerdem zeigte die chemische Blockade des im Cholesterolstoffwechsel eingebundenen ABC-Transporters P-gp durch verschiedene Inhibitorgenerationen (Verapamil, Valspodar, Tariquidar) deutliche Unterschiede in ihrer antiparasitären Wirksamkeit. Während Behandlungen mit Verapamil signifikant die Replikation von T. gondii, N. caninum und B. besnoiti hemmten und eine Anreicherung neutraler Lipide in Wirtszellen erzeugten, zeigten Valspodar-Behandlungen zwar ebenfalls anti-invasive und anti-proliferative Wirkungen, ohne jedoch die Abundanz neutraler Lipide zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu verringerte der spezifischste P-gp-Inhibitor Tariquidar ausschließlich die Invasion und Replikation von B. besnoiti, wirkte sich jedoch nicht auf T. gondii oder N. caninum aus, was parasitenspezifische Reaktionen nahelegt. Interessanterweise induzierte die Blockade des Scavenger-Rezeptors SR-BI durch BLT-1-Behandlungen signifikante hemmende Effekte sowohl auf die schnell replizierenden Kokzidien T. gondii, N. caninum und B. besnoiti als auch auf die pathogenen Eimeria-Spezies E. bovis und E. arloingi, was konservierte, SR-BI-assoziierte Mechanismen bei der intrazellulären Kokzidien-Replikation nahelegt. BLT-1-Behandlungen freier Sporozoiten und Tachyzoiten beinflussten jedoch ausschließlich die invasive Kapazität der letzteren Gruppe, begleitet von einem anhaltenden Ca++-Flux in diesen Parasitenstadien.
Schließlich belegten Studien zum Zellaustritt von N. caninum über Live-Cell-Imaging, dass dieser mit einer infektionsbedingten Ca++-Umverteilung mit erhöhten Ca++-Signalen innerhalb der Meronten verbunden war. Analysen zum ionophorinduzierten Austritt von N. caninum zeigten zudem, dass die Austrittsleistung des Parasiten hauptsächlich von der Merontenreife beeinflusst wurde und dass Ionophorbehandlungen keine Ca++-Umverteilung zwischen unterschiedlichen Infektionszeitpunkten (24 oder 42 h p. i.) verursachte.