Bewertung verschiedener diagnostischer Ansätze zur Überwachung der Paratuberkulose-Freiheit von Rinderherden
von Annika WichertIm Rahmen von Paratuberkulose-Bekämpfungsprogrammen ist es wesentlich, dass MAP-infizierte Herden mit geringem finanziellem Aufwand, aber mit ausreichender Sicherheit als solche erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene kostengünstige Ansätze zur Herdendiagnostik der Paratuberkulose bei Rindern evaluiert. Dabei wurde auch die Eignung der Diagnostikansätze für die Detektion von Herden mit niedriger Prävalenz an MAP-Ausscheidern untersucht.
In Studie 1 wurde die Herdendiagnostik mittels gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe untersucht. Es wurde eine Untersuchung dreier Herden mit jeweils 300 Tieren nachgestellt. Jede Herde wurde durch 300 Einzeltierkotproben, die bereits auf MAP untersucht worden waren, repräsentiert. Um eine unterschiedliche Intra-Herden-Prävalenz (1,00 %; 2,00 % und 4,33 %) abzubilden, wurden n MAP-positive Kotproben mit n=3; 6; 13 und 300−n MAP-negative Kotproben zusammengestellt. Pro Herde wurden zehn Stichprobenuntersuchungen simuliert. Hierfür wurden aus den 300 Einzeltierkotproben zufällig jeweils 80 Proben ausgewählt und jeweils zu 5er und 10er Pools zusammengefasst. Pools mit mindestens einer MAP-positiven Probe wurden mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein positiver Zusammenhang zwischen der Bakteriendichte in einem Pool und der Pool-Sensitivität (Wahrscheinlichkeit, einen Pool mit mindestens einer MAP-positiven Kotprobe als MAP-positiven Pool zu erkennen) besteht. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Pool-Sensitivität zwischen der Untersuchung von 5er und 10er Pools festgestellt werden. Die Pool-Sensitivität der Untersuchung von 5er und 10er Pools mit Direkt-PCR lag bei 47,0 % beziehungsweise 45,9 %. Die Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels bakterieller Kultur wich, sowohl bei Verwendung von 5er als auch von 10er Pools, nicht signifikant von der Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels Direkt-PCR ab. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Direkt-PCR und bakterieller Kultur die Sensitivität signifikant erhöhen kann. Wurden bei der Untersuchung von 10er Pools beide Labormethoden kombiniert, lag die Herden-Sensitivität für die Untersuchung der gepoolten Einzeltierkotproben einer Stichprobe zwischen 67,3 % und 84,8 %. In Herden mit niedriger Prävalenz von MAP-Ausscheidern genügt eine einmalige Untersuchung gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe nicht, um die Herde mit ausreichender Sicherheit zu erkennen.
In Studie 2 wurde die Eignung wiederholter Umgebungskotproben und gepoolter Einzeltiermilchproben für die MAP-Diagnostik auf Herdenebene evaluiert, da auch bei Anwendung dieser kostengünstigen Diagnostikansätze eine einmalige Untersuchung nicht ausreicht, um niedrig-prävalente Herden mit hoher Sicherheit zu erkennen. In 36 Thüringer Milchviehherden wurden innerhalb eines Jahres jeweils zwölf Bestandsbesuche durchgeführt, bei denen jeweils neben einer Gülleprobe eine Sockentupferprobe und drei Umgebungskotproben aus den Bereichen Vorwartehof und Haupttriebweg sowie aus dem Gruppenbereich mit Fress- und Liegeplätzen gewonnen wurden. All diese Proben wurden einzeln mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Zusätzlich wurde ein Pool aus Gülle und den übrigen drei Umgebungskotproben ebenfalls mittels Kultur und PCR untersucht. Außerdem wurden die im Rahmen von zwölf monatlichen Milchleistungsprüfungen gewonnenen Einzeltiermilchproben monatsweise zu 25er und 50er Pools zusammengefasst und mittels ELISA auf MAP-spezifische Antikörper untersucht. Mithilfe eines bayesianischen Modells wurden die kumulative Sensitivität und Spezifität für wiederholte Untersuchungen geschätzt, wobei die Kovarianzen zwischen den verschiedenen Tests und zwischen den wiederholten Tests berücksichtigt wurden. In Herden mit einer Prävalenz von mindestens 2 % MAP-Ausscheidern waren mindestens sieben Untersuchungen mittels Umgebungskotproben notwendig, um eine Sensitivität von 95 % zu erreichen. Um eine 95%ige Sensitivität in Herden mit einer Intra-Herden-Prävalenz von unter 2 % zu erzielen, war neben wiederholten Untersuchungen auch eine Kombination verschiedener Probenarten nötig.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass MAP-infizierte Herden mit niedriger Intra-Herden-Prävalenz bei einmaliger Untersuchung mithilfe kostengünstiger Untersuchungsmethoden nicht ausreichend zuverlässig detektiert werden. Dennoch können Umgebungskotproben und gepoolte Einzelmilchproben für die Überwachung MAP-freier Milchviehherden eingesetzt werden, wenn die Untersuchungen wiederholt durchgeführt werden. Eine Kombination von Probenarten und/oder Labormethoden kann die Sensitivität erhöhen. In Mutterkuhherden oder Betrieben mit Stroheinstreu kann die Untersuchung von Pools aus zehn Einzeltierkotproben mittels bakterieller Kultur und/oder Direkt-PCR zur Anwendung kommen. Um MAP-freien Herden eine hohe Wahrscheinlichkeit der Freiheit von Paratuberkulose attestieren zu können, ist regelmäßiges wiederholtes Testen (mit MAP-negativen Ergebnissen) nötig.
In Studie 1 wurde die Herdendiagnostik mittels gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe untersucht. Es wurde eine Untersuchung dreier Herden mit jeweils 300 Tieren nachgestellt. Jede Herde wurde durch 300 Einzeltierkotproben, die bereits auf MAP untersucht worden waren, repräsentiert. Um eine unterschiedliche Intra-Herden-Prävalenz (1,00 %; 2,00 % und 4,33 %) abzubilden, wurden n MAP-positive Kotproben mit n=3; 6; 13 und 300−n MAP-negative Kotproben zusammengestellt. Pro Herde wurden zehn Stichprobenuntersuchungen simuliert. Hierfür wurden aus den 300 Einzeltierkotproben zufällig jeweils 80 Proben ausgewählt und jeweils zu 5er und 10er Pools zusammengefasst. Pools mit mindestens einer MAP-positiven Probe wurden mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein positiver Zusammenhang zwischen der Bakteriendichte in einem Pool und der Pool-Sensitivität (Wahrscheinlichkeit, einen Pool mit mindestens einer MAP-positiven Kotprobe als MAP-positiven Pool zu erkennen) besteht. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der Pool-Sensitivität zwischen der Untersuchung von 5er und 10er Pools festgestellt werden. Die Pool-Sensitivität der Untersuchung von 5er und 10er Pools mit Direkt-PCR lag bei 47,0 % beziehungsweise 45,9 %. Die Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels bakterieller Kultur wich, sowohl bei Verwendung von 5er als auch von 10er Pools, nicht signifikant von der Pool-Sensitivität einer Untersuchung mittels Direkt-PCR ab. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Direkt-PCR und bakterieller Kultur die Sensitivität signifikant erhöhen kann. Wurden bei der Untersuchung von 10er Pools beide Labormethoden kombiniert, lag die Herden-Sensitivität für die Untersuchung der gepoolten Einzeltierkotproben einer Stichprobe zwischen 67,3 % und 84,8 %. In Herden mit niedriger Prävalenz von MAP-Ausscheidern genügt eine einmalige Untersuchung gepoolter Einzeltierkotproben einer Stichprobe nicht, um die Herde mit ausreichender Sicherheit zu erkennen.
In Studie 2 wurde die Eignung wiederholter Umgebungskotproben und gepoolter Einzeltiermilchproben für die MAP-Diagnostik auf Herdenebene evaluiert, da auch bei Anwendung dieser kostengünstigen Diagnostikansätze eine einmalige Untersuchung nicht ausreicht, um niedrig-prävalente Herden mit hoher Sicherheit zu erkennen. In 36 Thüringer Milchviehherden wurden innerhalb eines Jahres jeweils zwölf Bestandsbesuche durchgeführt, bei denen jeweils neben einer Gülleprobe eine Sockentupferprobe und drei Umgebungskotproben aus den Bereichen Vorwartehof und Haupttriebweg sowie aus dem Gruppenbereich mit Fress- und Liegeplätzen gewonnen wurden. All diese Proben wurden einzeln mittels bakterieller Kultur und Direkt-PCR untersucht. Zusätzlich wurde ein Pool aus Gülle und den übrigen drei Umgebungskotproben ebenfalls mittels Kultur und PCR untersucht. Außerdem wurden die im Rahmen von zwölf monatlichen Milchleistungsprüfungen gewonnenen Einzeltiermilchproben monatsweise zu 25er und 50er Pools zusammengefasst und mittels ELISA auf MAP-spezifische Antikörper untersucht. Mithilfe eines bayesianischen Modells wurden die kumulative Sensitivität und Spezifität für wiederholte Untersuchungen geschätzt, wobei die Kovarianzen zwischen den verschiedenen Tests und zwischen den wiederholten Tests berücksichtigt wurden. In Herden mit einer Prävalenz von mindestens 2 % MAP-Ausscheidern waren mindestens sieben Untersuchungen mittels Umgebungskotproben notwendig, um eine Sensitivität von 95 % zu erreichen. Um eine 95%ige Sensitivität in Herden mit einer Intra-Herden-Prävalenz von unter 2 % zu erzielen, war neben wiederholten Untersuchungen auch eine Kombination verschiedener Probenarten nötig.
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass MAP-infizierte Herden mit niedriger Intra-Herden-Prävalenz bei einmaliger Untersuchung mithilfe kostengünstiger Untersuchungsmethoden nicht ausreichend zuverlässig detektiert werden. Dennoch können Umgebungskotproben und gepoolte Einzelmilchproben für die Überwachung MAP-freier Milchviehherden eingesetzt werden, wenn die Untersuchungen wiederholt durchgeführt werden. Eine Kombination von Probenarten und/oder Labormethoden kann die Sensitivität erhöhen. In Mutterkuhherden oder Betrieben mit Stroheinstreu kann die Untersuchung von Pools aus zehn Einzeltierkotproben mittels bakterieller Kultur und/oder Direkt-PCR zur Anwendung kommen. Um MAP-freien Herden eine hohe Wahrscheinlichkeit der Freiheit von Paratuberkulose attestieren zu können, ist regelmäßiges wiederholtes Testen (mit MAP-negativen Ergebnissen) nötig.