Immunhistologische Charakterisierung feliner Meningeome und Etablierung feliner Meningeomzellkulturen
von Kim Isabel HegeDiese Doktorarbeit diente der klinischen Reevaluierung feliner Meningeom-Patienten, dem histologischen Regrading der Tumoren anhand der humanmedizinischen WHO-Klassifikation aus dem Jahr 2016 (Louis et al., 2016), der Charakterisierung des immunhistochemischen Expressionsmusters feliner Meningeome sowie der Etablierung einer Zellkultur aus einem felinen Meningeom.
Die klinische Reevaluierung der felinen Meningeom-Patienten ergab einen guten Therapieerfolg bei den durch operative Tumorexstirpation therapierten Patienten. Bis auf eine Patientenbesitzerin berichteten alle von einem guten Regenerationsgrad nach der Operation. Es lag eine mittlere Überlebenszeit von 32 Monaten vor mit einer maximalen Überlebenszeit von neun Jahren. Das Meningeom wurde bei den erfolgreich operierten Patienten nur in einem Fall eines spinalen Meningeoms mit zwei Rezidiven als Todesursache durch Euthanasie angegeben. Die Rezidivrate lag insgesamt bei 37%, wobei in einem Fall keine Symptome durch das Rezidiv ausgelöst wurden und im anderen Fall eine Re-Operation das Leben der Katze um weitere vier Jahre verlängerte. Es zeigte sich demnach, dass eine Re-Operation durchaus erfolgversprechend sein kann. Trotz des sehr guten Therapieerfolges durch die Operation wenn die unmittelbare postoperative Phase überlebt wurde, stellt eine Kraniotomie einen risikoreichen Eingriff dar. Insgesamt verstarben 25% der felinen Patienten perioperativ.
Im tierartlichen Vergleich mit den Daten aus der Studie von Will (2020) zeigt sich, dass die Überlebenszeiten der Katzen nach chirurgischer Intervention wesentlich länger waren als die der untersuchten Hunde. Die durchschnittliche Überlebenszeit der Hunde lag bei 43 Wochen (9,8 Monaten) nach Operation. Das Meningeom stellte zudem bei der Hälfte dieser erfolgreich operierten Hunde dennoch letztendlich die Todesursache dar.
Das histologische Regrading ergab, dass alle untersuchten felinen Meningeome vom fibromatösen, transitionalen, meningothelialen oder psammomatösen Subtyp waren. Dies sind alles Subtypen, die dem Grad I zuzuordnen sind. Bei den durch Will untersuchten kaninen Meningeomen hatten zusätzlich die Subtypen granularzellig, papillär, mikrozystisch und klarzellig vorgelegen. Psammomatöse Meningeome waren bei den untersuchten Katzen deutlich häufiger (24%) als bei den Hunden (4%). Auch der fibromatöse Subtyp war mit 15 % im Vergleich zum Hund mit 4% häufiger vertreten, wohingegen bei den kaninen Meningeomen der meningotheliale Subtyp mit 41% überwog, welcher bei den Katzen nur 15% ausmachte. Bei den felinen Meningeomen waren 94% dem benignen Grad I zuzuordnen, 6% dem maligneren Grad II und keines dem Grad III. Bei den Grad II Tumoren handelte es sich in einem Fall um einen Tumor mit erhöhter Mitoseaktivität und in einem Fall um einen Tumor mit Hirninvasion. Ersterer zeigte auch klinisch ein rasches Rezidiv-Verhalten, zweiterer war einem Sektionstier mit vorberichtlich neurologischen Symptomatik entnommen worden. Eine Korrelation des histologischen Grades und des biologischen Verhaltens der Tumoren war aufgrund der Tatsache, dass auch als Grad I eingestufte feline Meningeome rezidiviert hatten, nicht zuverlässig festzustellen.
Bei den kaninen Tumoren aus der Studie von Wills (2020) waren nur 16% als Grad I eingeordnet worden, 54% als Grad II und 29% als Grad III. Die kaninen Meningeome waren demnach histologisch als deutlich maligner einzustufen als die felinen Meningeome. Die untersuchten Hunde zeigten auch einen deutlich schlechteren klinischen Outcome als die Katzen. Dies zeigt, dass das humanmedizinische histologische WHO-Grading (2016) durchaus auch in der Tiermedizin eine prognostische Relevanz zu haben scheint. Innerhalb der felinen Patienten war die Prognose anhand des WHO-Grades allerdings nicht zuverlässig abzuschätzen, da diese fast alle als Grad I einzustufen waren und dennoch einen ganz unterschiedlichen klinischen Outcome aufwiesen.
Neben dem histologischen Regrading widmete sich diese Arbeit in Anlehnung an die Arbeit von Will (2020) der immunhistochemischen Untersuchung der felinen Meningeome mit den bereits etablierten Markern Vimentin, S100, GFAP und Zytokeratin. Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung neuer diagnostischer und bestenfalls prognostischer immunhistochemischer Marker. Die Etablierung von Desmoplakin als diagnostischer Marker und PHH3 als potenzieller prognostischer Marker gelang an den felinen Meningeomen problemlos. Die Etablierung eines Antikörpers für EMA und SSTR2A gelang trotz multipler Protokoll-Anpassungen nicht. EMA und SSTR2A stellen in der Humanmedizin die zum aktuellen Zeitpunkt wichtigsten immunhistochemischen Marker von Meningeomen dar. Die felinen Meningeome zeigten ebenfalls eine fragliche SSTR2A-Expression. Dennoch sollte die Etablierung möglicherweise mit anderen Antikörpern gegen SSTR2A unter anderen Bedingungen weiter getestet werden, da der Somatostatin-Rezeptor auch einen Ansatzpunkt für medikamentöse Therapien mit Somatostatin-Analoga darstellt und eine Expression von SSTR2A durch Meningeome anhand der Ergebnisse dieser Studie zumindest nicht ausgeschlossen werden kann.
Es zeigte sich, dass die felinen Meningeome fast alle demselben immunhistochemischen Expressionsmuster folgten mit einer Expression von Vimentin (stark, diffus, viele Zellen betreffend), S100 (schwächer, fokal, nur wenige Zellen betreffend) und Desmoplakin (stark, diffus, viele Zellen betreffend). Die meisten Meningeome waren hingegen negativ für GFAP und Zytokeratin. Einzelne Tumoren wiesen vereinzelte Abweichungen auf, wie eine leichte GFAP- oder Zytokeratin-Expression oder eine nicht vorhandene S100-Expression. Es gab in dieser Studie Hinweise darauf, dass eine positive Zytokeratin-Färbung bei felinen Meningeomen mit einer schlechteren Prognose assoziiert sein könnte. Die PHH3-Färbung war bei allen Tumoren gegeben, zeigte aber in nur einem Fall mehr als 4 Mitosen pro 10 HPF (Grad II) und in keinem Fall mehr als 20 Mitosen pro 10 HPF (Grad III) bei den felinen Meningeomen.
Es zeigte sich, dass sich feline und kanine Meningeome sowohl in Hinsicht auf ihr histologisches Erscheinungsbild als auch in ihrer klinischen Ausprägung und dem Operations-Erfolg deutlich unterschieden. Lediglich das immunhistochemische Expressionsprofil lieferte ähnliche Ergebnisse bei beiden Tierarten. Hierbei fiel nur ein Unterschied in der Proliferationsaktivität der Tumoren beider Tierarten auf, welcher zu einer stärkeren PHH3-Expression der kaninen Meningeome führte. Die anderen immunhistochemischen Marker zeigten ein sehr ähnliches Expressionsmuster bei Proben beider Tierarten. Dass Meningeome bei Hunden und Katzen eine unterschiedliche klinische Ausprägung und eine unterschiedlich gute Prognose in Bezug auf den Therapieerfolg aufweisen und dennoch ein sehr ähnliches immunhistochemisches Expressionsmuster haben zeigt, dass sich die Immunhistochemie mit den Markern Vimentin, S100, Zytokeratin, GFAP und Desmoplakin für die Diagnose eines Meningeoms eignet, jedoch keine signifikante prognostische Aussagekraft liefert. Diese Arbeit zeigt, dass gerade bei felinen Meningeomen der histologische Grad meist als benigne eingeschätzt wird und nicht zuverlässig mit dem Outcome des individuellen Patienten korreliert. Dies deckt sich mit den Angaben aus der Humanmedizin, in der gerade Grad I Tumoren doch gelegentlich ein maligneres Verhalten aufweisen als ihre Histologie vermuten lässt. Daher gewinnen dort molekularpathologische Untersuchungen zunehmend an Bedeutung, um die Prognose des einzelnen Meningeom-Patienten abzuschätzen. Dies stellt einen wichtigen und interessanten Schwerpunkt für zukünftige veterinärmedizinische Arbeiten dar. Es zeigt sich, wie veraltet die veterinärmedizinische WHO-Klassifikation (Koestner et al. 1999) insgesamt ist.
Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung einer primären Zellkultur aus felinen Meningeomzellen. Dies diente dazu, eine Grundlage für spätere Forschungsarbeiten zur Immortalisierung und in vitro Testungen von Chemotherapeutika zu bilden. Gerade bei kaninen Meningeomen ist, wie oben beschrieben, die Operation eher durch einen mittelfristigen Therapieerfolg charakterisiert, weshalb alternative Therapieoptionen wie eine Chemotherapie an Bedeutung gewinnen könnten. Die Etablierung einer primären Zellkultur gelang aus frischem Tumorgewebe zweier verschiedener feliner Meningeome vom psammomatösen und meningothelialen Subtyp gut. Die Charakterisierung der Zellen mittels Immunfluoreszenz und Immunhistochemie am Zellpellet ergab, dass die Kulturzellen den Zellen des Ursprungsgewebes entsprachen. Die Kulturen ließen sich mehrfach subkultivieren, ohne ihr Wachstumsverhalten stark zu verändern. Dies stellt eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten dar.
Die klinische Reevaluierung der felinen Meningeom-Patienten ergab einen guten Therapieerfolg bei den durch operative Tumorexstirpation therapierten Patienten. Bis auf eine Patientenbesitzerin berichteten alle von einem guten Regenerationsgrad nach der Operation. Es lag eine mittlere Überlebenszeit von 32 Monaten vor mit einer maximalen Überlebenszeit von neun Jahren. Das Meningeom wurde bei den erfolgreich operierten Patienten nur in einem Fall eines spinalen Meningeoms mit zwei Rezidiven als Todesursache durch Euthanasie angegeben. Die Rezidivrate lag insgesamt bei 37%, wobei in einem Fall keine Symptome durch das Rezidiv ausgelöst wurden und im anderen Fall eine Re-Operation das Leben der Katze um weitere vier Jahre verlängerte. Es zeigte sich demnach, dass eine Re-Operation durchaus erfolgversprechend sein kann. Trotz des sehr guten Therapieerfolges durch die Operation wenn die unmittelbare postoperative Phase überlebt wurde, stellt eine Kraniotomie einen risikoreichen Eingriff dar. Insgesamt verstarben 25% der felinen Patienten perioperativ.
Im tierartlichen Vergleich mit den Daten aus der Studie von Will (2020) zeigt sich, dass die Überlebenszeiten der Katzen nach chirurgischer Intervention wesentlich länger waren als die der untersuchten Hunde. Die durchschnittliche Überlebenszeit der Hunde lag bei 43 Wochen (9,8 Monaten) nach Operation. Das Meningeom stellte zudem bei der Hälfte dieser erfolgreich operierten Hunde dennoch letztendlich die Todesursache dar.
Das histologische Regrading ergab, dass alle untersuchten felinen Meningeome vom fibromatösen, transitionalen, meningothelialen oder psammomatösen Subtyp waren. Dies sind alles Subtypen, die dem Grad I zuzuordnen sind. Bei den durch Will untersuchten kaninen Meningeomen hatten zusätzlich die Subtypen granularzellig, papillär, mikrozystisch und klarzellig vorgelegen. Psammomatöse Meningeome waren bei den untersuchten Katzen deutlich häufiger (24%) als bei den Hunden (4%). Auch der fibromatöse Subtyp war mit 15 % im Vergleich zum Hund mit 4% häufiger vertreten, wohingegen bei den kaninen Meningeomen der meningotheliale Subtyp mit 41% überwog, welcher bei den Katzen nur 15% ausmachte. Bei den felinen Meningeomen waren 94% dem benignen Grad I zuzuordnen, 6% dem maligneren Grad II und keines dem Grad III. Bei den Grad II Tumoren handelte es sich in einem Fall um einen Tumor mit erhöhter Mitoseaktivität und in einem Fall um einen Tumor mit Hirninvasion. Ersterer zeigte auch klinisch ein rasches Rezidiv-Verhalten, zweiterer war einem Sektionstier mit vorberichtlich neurologischen Symptomatik entnommen worden. Eine Korrelation des histologischen Grades und des biologischen Verhaltens der Tumoren war aufgrund der Tatsache, dass auch als Grad I eingestufte feline Meningeome rezidiviert hatten, nicht zuverlässig festzustellen.
Bei den kaninen Tumoren aus der Studie von Wills (2020) waren nur 16% als Grad I eingeordnet worden, 54% als Grad II und 29% als Grad III. Die kaninen Meningeome waren demnach histologisch als deutlich maligner einzustufen als die felinen Meningeome. Die untersuchten Hunde zeigten auch einen deutlich schlechteren klinischen Outcome als die Katzen. Dies zeigt, dass das humanmedizinische histologische WHO-Grading (2016) durchaus auch in der Tiermedizin eine prognostische Relevanz zu haben scheint. Innerhalb der felinen Patienten war die Prognose anhand des WHO-Grades allerdings nicht zuverlässig abzuschätzen, da diese fast alle als Grad I einzustufen waren und dennoch einen ganz unterschiedlichen klinischen Outcome aufwiesen.
Neben dem histologischen Regrading widmete sich diese Arbeit in Anlehnung an die Arbeit von Will (2020) der immunhistochemischen Untersuchung der felinen Meningeome mit den bereits etablierten Markern Vimentin, S100, GFAP und Zytokeratin. Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung neuer diagnostischer und bestenfalls prognostischer immunhistochemischer Marker. Die Etablierung von Desmoplakin als diagnostischer Marker und PHH3 als potenzieller prognostischer Marker gelang an den felinen Meningeomen problemlos. Die Etablierung eines Antikörpers für EMA und SSTR2A gelang trotz multipler Protokoll-Anpassungen nicht. EMA und SSTR2A stellen in der Humanmedizin die zum aktuellen Zeitpunkt wichtigsten immunhistochemischen Marker von Meningeomen dar. Die felinen Meningeome zeigten ebenfalls eine fragliche SSTR2A-Expression. Dennoch sollte die Etablierung möglicherweise mit anderen Antikörpern gegen SSTR2A unter anderen Bedingungen weiter getestet werden, da der Somatostatin-Rezeptor auch einen Ansatzpunkt für medikamentöse Therapien mit Somatostatin-Analoga darstellt und eine Expression von SSTR2A durch Meningeome anhand der Ergebnisse dieser Studie zumindest nicht ausgeschlossen werden kann.
Es zeigte sich, dass die felinen Meningeome fast alle demselben immunhistochemischen Expressionsmuster folgten mit einer Expression von Vimentin (stark, diffus, viele Zellen betreffend), S100 (schwächer, fokal, nur wenige Zellen betreffend) und Desmoplakin (stark, diffus, viele Zellen betreffend). Die meisten Meningeome waren hingegen negativ für GFAP und Zytokeratin. Einzelne Tumoren wiesen vereinzelte Abweichungen auf, wie eine leichte GFAP- oder Zytokeratin-Expression oder eine nicht vorhandene S100-Expression. Es gab in dieser Studie Hinweise darauf, dass eine positive Zytokeratin-Färbung bei felinen Meningeomen mit einer schlechteren Prognose assoziiert sein könnte. Die PHH3-Färbung war bei allen Tumoren gegeben, zeigte aber in nur einem Fall mehr als 4 Mitosen pro 10 HPF (Grad II) und in keinem Fall mehr als 20 Mitosen pro 10 HPF (Grad III) bei den felinen Meningeomen.
Es zeigte sich, dass sich feline und kanine Meningeome sowohl in Hinsicht auf ihr histologisches Erscheinungsbild als auch in ihrer klinischen Ausprägung und dem Operations-Erfolg deutlich unterschieden. Lediglich das immunhistochemische Expressionsprofil lieferte ähnliche Ergebnisse bei beiden Tierarten. Hierbei fiel nur ein Unterschied in der Proliferationsaktivität der Tumoren beider Tierarten auf, welcher zu einer stärkeren PHH3-Expression der kaninen Meningeome führte. Die anderen immunhistochemischen Marker zeigten ein sehr ähnliches Expressionsmuster bei Proben beider Tierarten. Dass Meningeome bei Hunden und Katzen eine unterschiedliche klinische Ausprägung und eine unterschiedlich gute Prognose in Bezug auf den Therapieerfolg aufweisen und dennoch ein sehr ähnliches immunhistochemisches Expressionsmuster haben zeigt, dass sich die Immunhistochemie mit den Markern Vimentin, S100, Zytokeratin, GFAP und Desmoplakin für die Diagnose eines Meningeoms eignet, jedoch keine signifikante prognostische Aussagekraft liefert. Diese Arbeit zeigt, dass gerade bei felinen Meningeomen der histologische Grad meist als benigne eingeschätzt wird und nicht zuverlässig mit dem Outcome des individuellen Patienten korreliert. Dies deckt sich mit den Angaben aus der Humanmedizin, in der gerade Grad I Tumoren doch gelegentlich ein maligneres Verhalten aufweisen als ihre Histologie vermuten lässt. Daher gewinnen dort molekularpathologische Untersuchungen zunehmend an Bedeutung, um die Prognose des einzelnen Meningeom-Patienten abzuschätzen. Dies stellt einen wichtigen und interessanten Schwerpunkt für zukünftige veterinärmedizinische Arbeiten dar. Es zeigt sich, wie veraltet die veterinärmedizinische WHO-Klassifikation (Koestner et al. 1999) insgesamt ist.
Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung einer primären Zellkultur aus felinen Meningeomzellen. Dies diente dazu, eine Grundlage für spätere Forschungsarbeiten zur Immortalisierung und in vitro Testungen von Chemotherapeutika zu bilden. Gerade bei kaninen Meningeomen ist, wie oben beschrieben, die Operation eher durch einen mittelfristigen Therapieerfolg charakterisiert, weshalb alternative Therapieoptionen wie eine Chemotherapie an Bedeutung gewinnen könnten. Die Etablierung einer primären Zellkultur gelang aus frischem Tumorgewebe zweier verschiedener feliner Meningeome vom psammomatösen und meningothelialen Subtyp gut. Die Charakterisierung der Zellen mittels Immunfluoreszenz und Immunhistochemie am Zellpellet ergab, dass die Kulturzellen den Zellen des Ursprungsgewebes entsprachen. Die Kulturen ließen sich mehrfach subkultivieren, ohne ihr Wachstumsverhalten stark zu verändern. Dies stellt eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten dar.