NET- and MET formation as well as dendritic cell (DC)-derived immune reactions against the zoonotic parasite Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum, ein protozoischer Parasit, ist weltweit verbreitet und kann sowohl Menschen als auch Nutztiere infizieren. Das Hauptreservoir für diese parasitäre Infektion sind neugeborene Kälber. Das Auftreten einer lebensbedrohlichen Kryptosporidiose bei HIV-Patienten, die mit C. parvum infiziert sind, macht deutlich, wie wichtig eine starke adaptive Immunreaktion für die wirksame Bekämpfung dieses Parasiten ist. Derzeit gibt es nur begrenzte Erkenntnisse über die Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunreaktion gegen C. parvum bei Menschen und Rindern. Neutrophil extracellular traps (NETs), die auch als suizidale NETosis bezeichnet werden, sind ein hochwirksamer und seit langem bestehender angeborener Abwehrmechanismus, der von polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) zur Bekämpfung parasitärer Organismen wie Protozoen und Helminthen eingesetzt wird. Monozyten von Säugetieren sind eine Art von myeloischen Leukozyten, die aus dem Knochenmark stammen. Aufgrund ihrer verschiedenen Abwehrmechanismen spielen sie eine entscheidende Rolle bei der frühen angeborenen Immunantwort des Wirts. Dazu gehören das Vorhandensein von ATP-purinergen, CD14- und CD16-Rezeptoren sowie ihre Fähigkeit, an Oberflächen zu haften, zu wandern und Krankheitserreger zu phagozytieren. Monozyten besitzen auch entzündungshemmende und antiparasitäre Eigenschaften, was ihre wichtige Rolle im Immunsystem weiter unterstreicht. In jüngster Zeit wurde über die Bildung von extrazellulären Monozytenfallen (METs) als zusätzlicher Mechanismus zur Bekämpfung apikomplexer Parasiten berichtet. Allerdings gibt es in der Literatur derzeit keine Informationen über die Extrusion von METs in Bezug auf C. parvum-Oozysten oder Sporozoiten. In dieser Studie untersuchten wir den purinergen ATP-Rezeptor P2X1, die Glykolyse, das Notch-Signalisierung und die Laktat-Monocarboxylat-Transporter (MCT) in Rindermonozyten und PMN, die C. parvum unter zwei verschiedenen Sauerstoffbedingungen ausgesetzt waren: intestinale Physioxie (5 % O2) und Hyperoxie (21 % O2, was in Laborumgebungen üblich ist). Der Nachweis durch C. parvum ausgelöster suizidaler METs gelang durch die Anwendung mehrerer Verfahren. Erstens wurde mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie eine vollständige Ruptur der exponierten Monozyten beobachtet. Darüber hinaus wurde die Co-Lokalisierung von extrazellulärer DNA mit Myeloperoxidase (MPO) und Histonen (H1-H4) Durch Analyse von Immunofluoreszenz- und Konfokalmikroskopieaufnahmen nachgewiesen. Nach rasterelektronenmikroskopischen (SEM) Analysen führten die von C. parvum induzierten suizidalen METs nicht nur zum Einschluss der Oozysten, sondern behindern das Austreten der Sporozoiten aus den Oozysten. Mit Hilfe der 3D-holotomographischen Analyse von lebenden Zellen konnten wir die frühe Aktivierung von Rindermonozyten durch die Parasiten dokumentieren. Diese Aktivierung war durch die Bildung von Membranausstülpungen bei Kontakt zu C. parvum. Die Analyse mit Hilfe der 3D-holotomographischen Mikroskopie von lebenden Zellen machte frühe morphologische Veränderungen in PMNs sichtbar, die durch Parasiten ausgelöst wurden. Zu diesen Veränderungen gehörte die Bildung von Membranausstülpungen in Richtung C. parvum während der NETose. Ein signifikanter Rückgang der durch C. parvum ausgelösten suizidal NETosis wurde beobachtet, wenn PMNs mit dem purinergen Rezeptor P2X1-Inhibitor NF449 behandelt wurden, unabhängig von den Sauerstoffbedingungen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der P2X1-Rezeptor eine entscheidende Rolle bei der Bildung von NETs spielt, In ähnlicher Weise wurde bei der Hemmung der PMN-Glykolyse durch die Behandlung mit 2-Desoxy-Glukose ein leichter Rückgang der durch C. parvum ausgelösten suizidalen NETosis festgestellt, wenn auch nicht in signifikantem Ausmaß. Nach Messungen des energetischen Zustands der PMN führte die Exposition gegenüber C. parvum nicht zu einem Anstieg der extrazellulären Säuerungsrate (ECAR) oder der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in den Zellen. Die Verwendung von Inhibitoren, die auf die Monocarboxylat-Transporter (MCTs) der Plasmamembran für Laktat abzielen, führte nicht zu einer signifikanten Verringerung der C. parvum-induzierten NET-Extrusion. Nach Behandlungen mit zwei spezifischen Notch-Inhibitoren (DAPT und Verbindung E), wurde in Bezug auf PMN keine signifikante Verringerung der Notch-Signalübertragung beobachtet. In dieser Studie beschreiben wir erstmals die wichtige Rolle des purinergen ATP-Rezeptors P2X1 bei der durch C. parvum ausgelösten suizidal NETosis unter Physioxie (5 % O2). Außerdem heben wir die antikryptosporidialen Eigenschaften dieses Rezeptors hervor. Wenn Monozyten verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt wurden, führte die Verabreichung von NF449, einem Inhibitor des purinergen ATP-Rezeptors P2X1, nicht zu einer signifikanten Verringerung der C. parvum-induzierten METosis. Dies deutet darauf hin, dass der Zelltodprozess nicht von P2X1 abhängt. Wenn Monozyten mit 2-Desoxy-Glukose (2-DG) behandelt wurden, um die Glykolyse zu hemmen, kam es jedoch zu einer Verringerung der durch C. parvum ausgelösten METosis, obwohl der Rückgang statistisch nicht signifikant war. Anhand von Messungen des energetischen Zustands der Monozyten wurde festgestellt, dass die Zellen, die C. parvum ausgesetzt waren, keinen Anstieg der extrazellulären Säuerungsrate (ECAR) oder der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) aufwiesen. Die Behandlung mit einem Inhibitor von Laktat-Monocarboxylat-Transportern (MCT), wie AR-C 141990, reduzierte die durch C. parvum induzierte Extrusion von METs unter physioxischen Bedingungen (5% O2) signifikant. Auch die Verabreichung von DAPT oder Compound E, zwei selektiven Notch-Inhibitoren, hatte keine nennenswerten hemmenden Auswirkungen auf die Produktion von Rinder-MET. In dieser Studie präsentieren wir den ersten Nachweis für die von C. parvum vermittelte METose als Abwehrmechanismus. Wir fanden heraus, dass dieser Prozess unabhängig von P2X1 ist, aber auf MCT beruht. Außerdem konnten wir beobachten, dass diese Effekte speziell unter intestinalen Physioxie-Bedingungen mit 5% CO2 auftreten. Die Ergebnisse der METs deuten darauf hin, dass es antikryptosporidiale Effekte gibt, die durch das Einfangen der Parasiten und die Hemmung des Prozesses der Sporozoiten-Exzystation erreicht werden. Die Interaktion zwischen dendritischen Zellen (DC) und pathogenen Mikroorganismen ist ein entscheidender erster Schritt bei jeder adaptiven Immunantwort. Dendritische Zellen (DC) erkennen von Krankheitserregern stammende Moleküle und Alarmsignale und reagieren mit Aktivierung und Reifung. Wir haben primäre menschliche dendritische Zellen (DC) aus Monozyten von gesunden Blutspendern erzeugt. Diese DCs wurden dann in einer kontrollierten Laborumgebung C. parvum-Oozysten und Sporozoiten ausgesetzt. Im Allgemeinen erhöhte die Exposition gegenüber den Parasiten die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine/Chemokine IL-6 und IL-8 in den DC deutlich. Dieser Anstieg war vergleichbar mit dem Niveau, das bei der Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS), das als Positivkontrolle verwendet wurde, beobachtet wurde. Darüber hinaus kam es zu einer Hochregulierung von Reifungsmarkern und kostimulatorischen Molekülen, die für die Stimulation von T-Zellen notwendig sind, wie CD83, CD40 und CD86. Antigen-präsentierende Moleküle wie HLA-DR und CD1a sowie Adhäsionsmoleküle wie CD11b und CD58 wurden ebenfalls hochreguliert. Darüber hinaus zeigten menschliche DCs, die Parasiten ausgesetzt waren, eine verbesserte Zelladhäsion, eine erhöhte Mobilität und eine gesteigerte, wenn auch vorübergehende Fähigkeit, Oozysten und Sporozoiten von C. parvum zu zu phagozytieren. Diese verbesserte Phagozytose ist eine zusätzliche Voraussetzung für eine wirksame Antigenpräsentation. Im Gegensatz zu anderen mikrobiellen Stimuli führte die Exposition gegenüber C. parvum zu erhöhten oxidativen Verbrauchsraten (OCR) und nicht zu extrazellulären Säuerungsraten (ECAR) in DC. Dies deutet darauf hin, dass unterschiedliche Stoffwechselwege genutzt wurden, um Energie für die DC-Aktivierung zu erzeugen. Wenn menschliche DCs C. parvum ausgesetzt wurden, wiesen sie alle Merkmale einer erfolgreichen Reifung auf, die es ihnen ermöglichte, eine adaptive Immunantwort im Wirt wirksam zu initiieren.