Entwicklung und Etablierung des filamentösen Pilzes Magnaporthe oryzae als Expressionssystem für die heterologe Produktion von Proteinen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Laccase aus dem Basidiomyceten Coprinus cinereus erfolgreich in Magnaporthe oryzae exprimiert und sekretiert. Dies ist der erste Bericht über die heterologe Expression von Enzymen im Reisbranderreger M. oryzae. Vor der Anwendung von Optimierungs-Methoden konnten etwa 700 µg/l der Laccase aus dem Kulturmedium isoliert werden.
Auf verfahrenstechnischer Ebene scheinen die Parameter Temperatur und pH einen großen Einfluss auf die heterologe Expression in M. oryzae zu haben. Die Änderung des Fermentationsmaßstabs sowie die Anwendung des Fed-Batch-Verfahrens erwiesen sich ebenfalls als sehr erfolgreich bezüglich der Laccase-Expression.
Auf genetischer Ebene wurden hauptsächlich die Probleme mit Proteasen bzw. der posttranslationale Stress im Endoplasmatischen Retikulum adressiert. Dabei spielen möglicherweise intrazelluläre Proteasen eine große Rolle. Außerdem konnte durch die Überexpression des Transkriptionsfaktors Hac1, der die Expression einer Vielzahl von Helferproteinen induziert, der Anhäufung unkorrekt gefalteter Proteine im Endoplasmatischen Retikulum entgegengewirkt werden.
Durch die Verwendung des Promotors des housekeeping Gens Elongationsfaktor 1alpha aus M. oryzae konnten etwa 10 mg/l Laccase aus dem Kulturmedium isoliert werden. Außerdem wurde im Laufe dieser Arbeit ein Promotor identifiziert, der durch Maltose induzierbar ist und damit die Regulation der Expression in M. oryzae zulässt.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass M. oryzae als alternatives Expressionssystem für artfremde Enzyme dienen kann. Eine Kombination der in dieser Arbeit verwendeten Optimierungs-Methoden könnte eine Proteinmenge von bis zu 400 mg/l ergeben. Anhand des Reisbranderregers könnte der Sekretionsweg in filamentösen Pilzen weiter aufgeklärt werden.