Die phylogenetische Charakterisierung einer neuen Pathogenitätsinsel (LEE) des Stammes RW1374 (O103:H2) und anderer STEC-Stämme

Pathogenitätsinseln (PAIn) sind große chromosomale DNS-Regionen, die verschiedene Virulenzfaktoren kodieren und über einen horizontalen Gentransfer erworben wurden (18, 50). Ein häufiger Insertionsort von Pathogenitätsinseln stellen tRNS-Gene dar (86). Der Locus of Enterocyte Effacement (LEE) stellt eine solche Pathogenitätsinsel dar. Die meisten enteropathogenen Escherichia (E.) coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) verfügen über eine solche LEE-PAI. Sie konnte aber auch in verwandten Bakterienspezies, wie Citrobacter (C.) rodentium und Escherichia (E.) alvei, nachgewiesen werden. Der LEE kodiert ein Typ III-Sekretionssystem, ein Adhäsin (Intimin), welches den engen Kontakt des Bakteriums zur Epithelzelle vermittelt, sowie verschiedene über das Sekretionssystem sezernierte Proteine. Der LEE ist verantwortlich für die Ausbildung sog. Attaching-and-Effacing- (AE-) Läsionen des Darmepithels (73). Der Prototyp des LEE, der innerhalb des tRNS-Locus für Selenocystein (selC) inseriert ist, wurde 1995 bei dem humanen EPEC-Stamm E2348/69 (O127: H6) entdeckt und definiert (93). Innerhalb desselben Insertionsortes befindet sich ein weiterer LEE bei dem EHEC-Stamm EDL933 (O157: H7) (112). Benkel et al. (14) beschrieben einen zweiten LEE-Insertionsort für den bovinen EHEC-Stamm 413/89-1 (O26: H-) innerhalb des tRNS-Locus für Phenylalanin (pheU). Jores et al. (69) wiesen den dritten LEE-Insertionsort bei dem bovinen EHEC-Stamm RW1374 (O103: H2) innerhalb des pheV-Locus nach. Des weiteren wurde im pheU-Locus des Stammes RW1374 eine LEE-negative genomische Insel nachgewiesen (25). Der Erwerb einer LEE-PAI stellt ein Schlüsselereignis während der Entwicklung pathogener E. coli-Stämme dar. Die Insertion einer LEE-PAI in unterschiedliche tRNS-Gene wirft jedoch noch immer diverse Fragen hinsichtlich der Evolution AE-positiver Bakterien auf:

• Gab es ursprünglich nur einen LEE-positiven Urstamm, von dem ausgehend sich alle anderen LEE-postiven Stämme entwickelt haben?
• Oder wurde der LEE zu unterschiedlichen Zeiten in unterschiedliche Orte einer oder verschiedener Abstammungslinien eingefügt?

Für viele E. coli- und verwandte Bakterienstämme gibt es noch keine klaren Erkenntnisse über einen LEE-Insertionsort, obschon die Existenz eines LEE sicher nachgewiesen ist. Whittam et al. (165, 96) teilten verschiedene EPEC- und EHEC-Stämme in 4 Cluster ein, bei denen bereits zwei LEE-Insertionsorte bestimmt wurden (168, 144). Dennoch gab es Hinweise auf einen unbekannten Insertionsort bei einigen dieser Stämme.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der LEE-Insertionsort der E. coli-Stämme des EPEC2- und EHEC2-Clusters, einiger boviner EHEC- sowie C. rodentium- und E. alvei-Stämme mittels Polymerase-Kettenreaktion und DNS-DNS-Hybridisierungen bestimmt werden, um aus den Ergebnissen Hinweise auf die Evolution LEE-positiver AE-Bakterien zu ziehen. Weiterhin sollte insbesondere die LEE-PAI des bovinen EHEC-Stammes RW1374 (O102: H3) untersucht werden. Zu diesem Zweck sollten die flankierenden Regionen der LEE-PAI mittels einer in der Literatur beschriebenen Methode durch die Insertion von Erkennungssequenzen für eine Restriktionsendonuklease markiert werden, um die Pathogenitätsinsel aus dem Genom herauszuschneiden. Die Isolierung der LEE-PAI könnte einer zukünftigen Charakterisierung der auf ihr lokalisierten Virulenzfaktoren und der damit assoziierten Pathogenität dienen. Des weiteren sollte das Intimin-Gen (eae) des LEE von RW1374 markiert und der mutagenisierte Stamm in einem Konjugationsexperiment eingesetzt werden. Die Übertragung des LEE in apathogene E. coli-Laborstämme sollte die Hypothese eines horizontalen Gentransfers via konjugativer Transposition bekräftigen, um die Entwicklung von AE-Pathogenen weiter aufzuklären. Die Mutation des eae-Gens und die Markierung der LEE-PAI dieses bovinen EHEC-Stammes sollten zudem funktionellen Untersuchungen hinsichtlich der Fähigkeit im Rahmen eines Zellkulturtests die typischen AE-Läsionen auszulösen, dienen. Somit leistet dieser Test einen Beitrag zur Aufklärung von Fragen bezüglich AE-Läsionen auslösender Faktoren.