Struktur-Eigenschaftsbeziehung von quervernetzten Proteinkristallen

In biotechnologischen Prozessen bietet die Nutzung von immobilisierten Enzymen in Form
von quervernetzten Proteinkristallen (CLECs) viele Vorteile, wie eine hohe volumenspezifische
katalytische Aktivität und größere Resistenz gegenüber chemischen und enzymatischen
Angriffen. Voraussetzung für eine Prozessierbarkeit und Wiederverwendbarkeit der Immobilisate
ist jedoch neben dem Erhalt der enzymatischen Aktivität der Proteinkristalle deren
mechanische Stabilität. Dabei hängen mechanische Stabilität wie auch Enzymaktivität einerseits
eng mit der Kristallstruktur und somit mit der Aminosäuresequenz der Proteine,
andererseits mit dem gewählten Vernetzungsreagenz und -grad zusammen. Das Ziel dieser
Arbeit war es daher, Zusammenhänge zwischen der Enzymstruktur und den resultierenden
Eigenschaften von CLECs aufzuklären. Da die Strukturbildung der CLECs durch
die einzelnen Prozessschritte des gesamten Herstellungsprozesses, beginnend mit der genetischen
Modifikation über Produktion und Reinigung der Enzyme, der Kristallerzeugung
und -charakterisierung bis zur Formulierung beeinflusst wird, muss diese auch als Ganzes
in die Betrachtungen einbezogen werden. Als Basis für die Untersuchungen wurden mittels
verschiedener Protein Engineering Methoden Aminosäuren auf der Oberfläche des gefalteten
Wildtyp Enzyms ausgetauscht, um neue potentielle Vernetzungsstellen innerhalb der später
hergestellten Proteinkristalle einzubauen und somit die mechanischen Kristalleigenschaften
zu verbessern. Das hierfür eingesetzte, industriell relevante Modellprotein, die Halohydrindehalogenase,
wurde im Rahmen einer Kooperation am Institut für Biochemie der Technischen
Universität Braunschweig genetisch modifiziert, hergestellt und charakterisiert. Der Fokus
dieser Arbeit lag dabei auf der Entwicklung von Methoden zur Kristallisation, der Quervernetzung
und der anschließenden mechanischen Charakterisierung. Auf Basis des Einflusses
der genetischen Mutation sowie ausgewählter Formulierungsparameter und der hieraus resultierenden
strukturellen Proteineigenschaften wurde ein statistisches Modell zur Aufklärung
der Struktur-Eigenschaftsbeziehung von CLECs abgeleitet.
Basis des statistischen Modells bildet die dreidimensionale Kristallstruktur mit allen relevanten
Aminosäuren, die mit dem gewählten Vernetzungsmolekül innerhalb der spezifischen
Länge des Linkers mögliche Vernetzungsbindungen ausbilden können. Die Anteile aller möglichen
Brücken innerhalb des Kristalls in die jeweilige Belastungsrichtung wurden aufsummiert,
um das mechanische Verhalten der CLECs zu beschreiben. Hierüber konnten die Zusammenhänge,
wie z. B. das anisotrope Kristallverhalten bzw. der Einfluss des Linkers oder
der Mutation, auf das mechanische Verhalten wiedergegeben werden. Um die Gültigkeit des
Modells zu validieren, wurden mechanische Eigenschaften nativer Kristalle und der CLECs,
wie bspw. Härte, E-Modul und elasto-plastische Verformungsarbeiten auf unterschiedlichen
Größenskalen mittels Rasterkraftmikroskopie und Nanoindentation untersucht. Eine besondere
Herausforderung lag auf der Methodenetablierung für eine zuverlässige, statistisch abgesicherte
mechanische Charakterisierung von Biopartikeln in geringem Flüssigkeitsvolumen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit vermitteln ein Verständnis der zugrundeliegenden
Wechselwirkungen, Zusammenhänge und Limitierungen zwischen der Struktur und den Eigenschaften
von quervernetzten Proteinkristallen und können daher als ein grundlegender
Baustein für die Herstellung von maßgeschneiderten CLECs genutzt werden.